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铁皮石斛人工快繁及杂交技术

LOTUS NEWS

2012-07-24 09:44:42

    铁皮石斛人工快繁及杂交技术

    铁皮石斛又名黑节草,为兰科石斛属多年生常绿草本植物,是一种名贵药材,在《道藏》中被列为中华九大仙草之首。铁皮石斛主要药用成分为石斛多糖,具有提高人体免疫功能、抗衰老、防治肿瘤和心血管疾病,以及改善睡眠、防治白内障等疾患的功能。但铁皮石斛种子极小,无胚乳,自然条件下需与某些真菌共生才能萌发,自然繁殖率极低,加上人为过度采集和自然环境破坏,目前我国野生铁皮石斛资源濒临灭绝,已被列为国家二级保护植物。龙岩市连城县冠豸山等地野生铁皮石斛资源利用历史悠久,但采集量逐年下降。为了保护珍稀铁皮石斛野生资源和促进铁皮石斛的开发利用,笔者采用现代生物组织培养技术,对铁皮石斛开展了人工杂交育种、种胚离体培养和快速繁殖、组培苗移栽等关键技术的研究,其研究结果如下。
    材料与方法
    人工杂交育种
    铁皮石斛系雌雄合生蕊柱。用牙签挑去白色的药帽,露出黄色的花粉粒,用牙签蘸取花粉粒,将蘸住花粉粒的牙签尖轻轻接触母本雌蕊的凹陷处,使其蘸上花粉粒,以不损坏合生蕊柱为原则。试验设4种授粉方式(表1):①自花授粉;②异花授粉;③开花后2~5d异花授粉;④开花后6~9d异花授粉。
    种胚萌发
    蒴果采收 11~12月是铁皮石斛蒴果成熟时期,当蒴果外表转浅黄绿色、达到发育成熟而尚未开裂时采收。
    蒴果处理 蒴果用75%酒精进行果实表面消毒30s,无菌水冲洗3次,用0.1%升汞消毒10min,无菌水漂洗3次,在无菌条件下,将处理过的果实切开一个口子,取出种子在解剖镜下计数后,分别撒播在4种诱导培养基(表2)上,每种培养基播种5瓶,每瓶播种20粒种子,观察统计萌发率、萌发时间、生长势等。
    原球茎增殖培养
    在前人研究的基础上,在增殖培养基中添加天然有机营养物(表3)。将种子诱导产生的原球茎分别接种在6种培养基上(表3),每种培养基接种5瓶,每瓶接种10个原球茎,培养50d后统计原球茎的增殖倍数。在培养过程中,观察生长状况等。
    壮苗生根培养
    当原球茎分化的幼苗2~3cm时,移入4种生根培养基中进行生根培养(表4),60d后观测记载苗高、根系条数和根系长度。每种培养基接种100株幼苗,3次重复。
    组培苗移栽
    移栽前瓶苗炼苗10d,适应自然环境后,选取肉质茎有3~4个节间、长有4~5片叶的苗进行移栽,用多菌灵1000倍液浸泡整株小苗10min,捞出后沥干。用水苔作为移栽基质,移栽前期注意遮阳、保湿,并做好病虫害防治。
    组培条件
    前述1.2、1.3、1.4方法中,培养基均加蔗糖3%、琼脂0.7%,PH值5.8,培养温度25℃左右,光照12h/d,光照强度1500~2000lx,培养室湿度70%。
    结果与分析
    人工授粉育种
    试验发现(表1),铁皮石斛以异花授粉为主,自花授粉成功率仅为25%,异花授粉成功率高达80%;授粉最好选择在开花后2~5d进行,此时花粉黏性高,雌蕊也有明显的分泌液、活力强,授粉成功率较高,随着开花时间的推移,花粉活力降低,授粉成功率也降低。授粉成功后的2~3d花瓣萎缩,4~6d花柄开始变粗、颜色变为深绿色,10d后可看到果实的雏形,而授粉失败的花朵在3~5d内变黄脱落。
    种子萌发诱导培养
    种子诱导培养8~19d后变得鲜绿,可见胚长大,呈球形;30~45d部分发育成原球茎,圆球形的原球茎上有尖尖突起的叶原基。从表2可以看出,接种在1/2MS+蛋白胨2g/L培养基上的原球茎颜色最浓绿,直径也最大、最健壮,发芽率达到95%,萌发时间最短(8d),说明培养基1/2MS+蛋白胨2g/L是最适宜的种子萌发培养基。已知蛋白胨对铁皮石斛种子萌发有较好的促进作用,因此,添加蛋白胨可补偿铁皮石斛种子不含胚乳的不足。另外,1/2MS培养基比MS培养基诱导效果好,说明无机盐浓度过高不利于种子发芽,会造成部分胚褐化死亡。
    原球茎增殖培养
    从表3中可看出,1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+15%马铃薯培养基的增殖效果最好,原球茎增殖速度快,培养50d后原球茎增殖可达到培养基表面之上2~3cm高,增殖系数达到5.7,且原球茎颜色浓绿、有光泽、直径大、生长健壮。从6种增殖培养基的增殖效果看,不添加任何生长调节剂和天然有机物的1/2MS培养基表现最差,说明添加植物生长调节剂6-BA与NAA有利于原球茎的增殖;而添加天然有机物的,除了添加香蕉的增殖系数降低、苗有点微黄外(可能是香蕉对原球茎的增殖有抑制作用),其他天然有机物对原球茎增殖有明显的促进效果。
    壮苗生根培养
    从表4可以看出,1/2MS+NAA0.5mg/L+15%香蕉培养基的分化苗生长状况最好,苗高达7.2cm、根数达5.6条、根长达5.4cm、根系发达、茎粗、叶较浓绿且有光泽,说明1/2MS+NAA0.5mg/L+15%香蕉为分化幼苗最佳生根培养基。从表4还可看出,植物生长调节剂NAA有促进壮苗生根的作用,添加天然有机物马铃薯对壮苗生根的影响不大。
    组培苗移栽
    刚移栽的组培苗,水分管理很关键,缺水生长缓慢、干枯、成活率低。但浇水过多则会烂根,温度高、湿度大时会引发软腐病发生。移栽后的1周内空气湿度宜保持在80%左右,1周后植株开始发新根,空气湿度可保持在70%左右。基质保持干湿交替有利于发根长芽。苗期易发生的病害主要为软腐病及炭疽病,可用50%多菌灵800倍液或50%甲基托布津1000倍液喷雾2~3次。虫害主要有蜗牛,为害幼茎、嫩叶,可采取人工捕杀、毒饵诱杀等方法防治。本试验移栽的成活率可达到90%以上,移栽1年后苗高可达到20cm以上。
    小结与讨论
    龙岩市连城县冠豸山等地自古以来就有优质野生铁皮石斛中药材,并且至今仍有家传的专业采摘加工铁皮石斛专业农户。经过3年的研究,采用杂交铁皮石斛种子进行组培快繁,可诱导更多胚状体,提高繁殖系数,短期内可提供大量的种苗,解决了自然条件下石斛种苗繁育难的问题,对保护和开发利用珍稀铁皮石斛野生资源具有积极意义。
    目前大量组培繁育都采用种子为组培源材料,而铁皮石斛的蒴果在自然界中十分有限且难找。本研究摸索出的授粉育种技术结实率达83%,可解决组培繁育的种源问题,同时为今后铁皮石斛优良品种选育奠定基础。
    本试验筛选出了最适宜的种子萌发培养基为1/2MS+蛋白胨2g/L,发芽率达95%;原球茎增殖培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+15%马铃薯,增殖系数达到5.7;壮苗生根培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L+15%香蕉,苗高7.2cm、根数5.6条。试验发现,在铁皮石斛的组培快繁不同阶段添加天然有机物具有一定的促进效果,这与蒋林等人研究结果相似。此外,组培苗移栽前10d进行炼苗,再用50%多菌灵1000倍液浸泡10min,同时注意遮阳、保湿和病虫害防治,移栽成活率可达90%以上。

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